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Product Information
ZymeBright™ 位点特异性DBCO/BCN修饰寡聚核苷酸抗体偶联试剂盒（2x 叠氮化物）是一款新型、操作简便且高效的快速偶联试剂盒，可实现抗体FC端的定点偶联。该设计从根源上避免了传统随机偶联技术导致的抗体活性降低、批间差异等显著缺点。该试剂盒可广泛应用于抗体偶联药物（ADC）、抗体-寡核苷酸偶联物（AOC）、流式细胞分析、免疫荧光、免疫印迹等多种常规实验场景，兼顾实验准确性与操作便捷性。
该试剂盒适用于Rabbit IgG，Rat IgG1 & IgG2a，Human IgG1-4 和Mouse IgG1 & IgG3 等作为骨架的抗体或融合蛋白。
核心优势:
1. 定点偶联，信号稳定：偶联物与抗体FC端共价结合，实现精准定点偶联，既保证了荧光信号强度的均一性，又有效降低了非特异性信号干扰，提升实验重复性。
2. 高活性保留，特异性优良：偶联位点远离抗体Fab端活性中心，仅特异性共价结合于FC端，不影响抗体Fab端对靶抗原的识别与结合能力，确保抗体原有生物学活性不受损伤。
3. 偶联效率高，无需纯化：试剂盒偶联效率优异，偶联过程中抗体无损耗，偶联后有效偶联抗体得率高，可直接用于流式细胞分析、免疫荧光、免疫印迹等多种常规实验，无需额外纯化步骤，大幅节省实验时间。
产品信息
货号 | 名称 | 组分规格 |
Component A (PK3007X-A) | Antibody Modifier Reagent (Vial A) | 5 uL |
Component B (PK30100-B) | Lyophilized Linker (2x Azide) (Vial B) | 100 ug |
Component C (PK3007X-C) | Lyophilized PTGase (Vial C) | 3 mg |
Component D (PK3007X-D) | Conjugation Buffer (Vial D) | 200 uL |
Component E (PK3007X-E) | Quenching Reagent (Vial E) | 5 mg |
Component F (PK3007X-F) | 0.6 mL Low Adhesion Tube | 0.6 mL*2 |
Labeling Scale: 100 ug unconjugated antibody | ||
保存条件
该试剂盒在-20℃条件下可保存至少一年。开封后应置于2-8℃环境中保存，避免光照和潮湿以保持试剂稳定性。试剂首次启用后必须在一周内使用完毕。
使用方法
1. 偶联操作流程：
操作前请将所有试剂（除Modifier Vial A和PTGase Vial C外）平衡至室温（15~25℃），Modifier Vial A和PTGase Vial C试剂现用现取，全程注意无菌操作，避免试剂污染。
1.1 Modifier 抗体的预处理
准备抗体，置换PBS缓冲液，浓度在1 mg/mL。取 2 uL 的Modifier Vial A加入到100 uL（浓度为1 mg/mL）抗体溶液并置于低吸附 0.6 mL 微量反应管中，轻柔涡旋混匀10~15 s，置于37℃、振幅3 mm、800 rpm恒温振荡器中孵育30 min。如果恒温振荡器的振幅在2 mm，增加转速至1000 rpm。
注意：此步反应完成后请尽快进行下一步操作，不宜长时间放置（建议≤30 min），避免抗体活性受损。
1.2 Lyophilized Linker Vial B的溶解
使用0.1 mL 的无菌PBS溶液溶解Vial B管，轻柔混合均匀，确保Vial B完全溶解，无沉淀或絮状物。
1.3 PTGase Vial C的溶解
使用0.6 mL 的无菌PBS溶液溶解PTGase Vial C，涡旋混匀10~15秒，确保其完全溶解。
注意：PTGase Vial C需现用现溶，溶解后立即使用，放置时间过长（超过1小时）会导致酶活性衰减，影响偶联效率。
1.4 偶联反应
向上述反应管(1.1)中依次加入8 uL Vial B溶液(1.2)，20 uL PTGase Vial C溶液(1.3)和 47 uL Conjugation Buffer Vial D。所有试剂加入后，涡旋混匀20秒，置于37℃、振幅3 mm、800 rpm恒温振荡器中避光孵育18~24小时。如果恒温振荡器的振幅在2 mm，增加转速至1000 rpm。
1.5 终止反应
偶联反应完成后，使用 100 uL PBS溶液溶解Quenching Reagent Vial E，涡旋混匀10~15 秒，待完全溶解后向上述反应管(1.4)中加入 83 uL Quenching Reagent Vial E，轻柔混匀，避光室温孵育30 min，终止偶联反应。
2. 点击化学反应（Click Chemistry）:
2.1 抗体-Linker置换缓冲液
终止反应完成后，请使用超滤管10-30 kDa MWCO除上述反应液中的游离的叠氮，使用无菌PBS + 2 mM EDTA的缓冲液平衡超滤管至2个柱体积，将上述管(1.5)抗体反应液进行超滤置换缓冲液（无菌PBS + 2 mM EDTA的缓冲液）。
置换缓冲液的抗体使用超微量分光光度计定量，计算抗体浓度。纯化后的抗体可直接用于偶联，可以2-8℃短期保存，长期保存需-20℃。
2.2 溶解Oligonucleotide样品
将DBCO修饰的Oligonucleotide溶解于无DNA/RNA酶的超纯水中，可以 2-8℃短期保存，长期保存需-20℃。
2.3 点击化学反应
按照抗体与DBCO-Oligonucleotide摩尔比1:3-1:6，将DBCO-Oligonucleotide溶液缓慢加入抗体-Linker溶液中。
如果需要，可以用反应缓冲液无菌PBS + 2 mM EDTA补足至合适体积。用移液枪轻轻吹打或轻轻涡旋, 避免产生气泡。室温（25℃）反应 22 h。
2.4 CleanAb Kit去除游离寡核苷酸
使用Proteintech的CleanAb Kits（Cat No. CK001）去除未结合的游离寡核苷酸，具体步骤详见CleanAb Kits（Cat No. CK001）说明书。
若短期使用建议在 PBS 中-20℃保存，如果长期使用及后续实验不受干扰，可在30%甘油和少量BSA条件下保存。
2.5 寡核苷酸偶联抗体的分析
寡核苷酸偶联抗体的效果可通过凝胶电泳检验，在凝胶电泳结束后用考马斯亮蓝染色剂染色并脱色，在 TAE 或者 TBE 缓冲液中进行凝胶的 EB 染色，孵育 30 分钟。分析寡核苷酸与抗体偶联效果，及游离寡核苷酸去除情况。
寡核苷酸偶联抗体的效果可通过SEC-uHPLC分析，并设立标准品对比。该方法是一种基于分子大小分离的HPLC技术。它利用具有不同孔径的固定相（填料）对样品中的蛋白质进行分离，使得大分子先于小分子通过色谱柱，从而实现蛋白质的分离和纯度分析。
寡核苷酸偶联抗体的效果可通过流式细胞仪器分析，可以选用Proteintech抗寡聚核苷酸抗体作为二抗进行检测，DNA Recombinant monoclonal antibody（Cat No. APC-85854和CL488-85854），dsRNA Recombinant monoclonal antibody（CL488-85780-2）。
注意事项
1. 该试剂盒不仅可以作为DBCO/BCN修饰寡聚核苷酸偶联，也可以为客户定制其他甲基四嗪 Linker与TCO修饰的偶联物和巯基 Linker与MAL修饰物的偶联物。
2. 试剂平衡：进行偶联操作前，所有试剂（除Modifier Vial A和PTGase Vial C之外）需提前15~30分钟平衡至室温，避免低温试剂影响反应效率。
3. 自备试剂：实验需自备10 mM、pH7.4的PBS缓冲液，建议提前灭菌处理，确保无菌无杂质。
4. 沉淀说明：抗体偶联完成后，若偶联物出现少量沉淀，属于正常特例情况，不影响后续实验结果，可直接使用。
5. 无菌操作：全程严格遵循无菌操作规范，避免试剂污染，否则会导致偶联失败或抗体活性受损。
6. 避光操作：若偶联物为荧光分子，对光敏感，偶联反应及抗体储存过程中需全程避光，避免荧光淬灭。
7. 试剂保存：未开封试剂盒需按说明书要求储存（通常为-20℃避光保存），开封后剩余试剂需密封，按对应条件储存，尽快使用完毕。开封后应置于2-8℃环境中保存，避免光照和潮湿以保持试剂稳定性。试剂首次启用后必须在一周内使用完毕。
8. 反应体系中甘油的含量应<10%。
9. 最佳的恒温振荡器是恒温振荡金属浴。
缓冲液兼容性
试剂组分 & 条件 | |
纯化抗体 | 是 |
腹水、血清、杂交瘤或组织培养基中的抗体 | 否 |
抗体浓度 | 0.5-2 mg/mL |
pH | 6.5-8.0 |
无胺缓冲液（如MES, MOPS, HEPES, PBS） | 是 |
非缓冲盐（如氯化钠） | 是 |
BSA | 是 |
叠氮化钠 | 是 |
螯合剂（如EDTA） | 是 |
甘油 | <10% |
糖类 | 是 |
明胶 | 未知 |
Tris | 是 |
甘氨酸 | 否 |
硫柳汞 | 是 |
碘酚 | 是 |
Proclin | 是 |
硼酸盐缓冲液 | 是 |
一级胺（如赖氨酸、肽或乙醇胺） | 否 |
重金属离子（Zn²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺ 或 Fe³⁺） | 否 |
