作者：Anna Katharina Schrattel – 海德堡大学医院，海德堡大学

类器官已成为生物医学研究中最有前景的工具之一。它们是由诱导多能干细胞（iPSCs）衍生的能够模拟器官特异性结构和功能的三维培养系统，因此在模型开发和疾病方面尤为重要。不同类型的心脏类器官在研究心脏发育、先天性心脏病、心脏毒性以及再生医学等方面，均展现出巨大的应用潜力。

图1 - hiPSC衍生的心脏类器官。类器官用DAPI和α平滑肌肌动蛋白（a-SMA）抗体染色，并用THUNDER转盘共聚焦显微成像系统成像。

此图由海德堡大学毒理学系的Lisa Gölz博士拍摄并慷慨提供。

一、心脏类器官有哪些类型？

类器官的种类持续拓展，主要包括自组装型心脏类器官、工程化心肌组织（EHT）以及器官芯片心脏模型。构建这类模型的细胞来源主要为干细胞，涵盖诱导多能干细胞（iPSCs）与胚胎干细胞。经重编程获得的诱导多能干细胞可分化为多种细胞类型，也可用于构建iPSC来源的类器官^[1]。与传统二维单层细胞培养不同，心脏类器官具备多细胞复杂结构，包含心肌细胞、成纤维细胞及内皮细胞等，可自发节律性收缩，模拟心脏搏动。

二、心脏类器官是如何产生的？

心脏类器官有多种形态，对应的培养方案也各不相同。其共同特点是通过复杂分化过程调控信号通路，并构建支持性细胞微环境。图2为2023年文献报道的 hiPSC 三维心脏诱导方案。该模型可实现功能性心室心肌与心外膜的自组装，可形成具备功能的心室心肌与心外膜自组装结构，命名为心外膜类器官（epicardioid）^[2]，方案可根据实验室条件优化。

图2 - 将人诱导多能干细胞（hiPSCs）诱导成3D心脏类器官的实验流程示意图

• 必备材料

1. 细胞：人诱导多能干细胞（hiPSC）
2. 培养板：96孔透明圆底超低附着微孔板，配合共价键水凝胶。
3. 培养基及添加剂：Essential 8培养基，青霉素/链霉素，EDTA（0.5 mM），PBS（不含钙镁离子）。
4. 基础分化培养基成分：DMEM/F-12 + GlutaMAX，IMDM，脂质浓缩物，IMDM + 10% BSA，转铁蛋白，α-硫代甘油。
5. 生长因子和小分子：BMP4，Activin A，bFGF，胰岛素，LY-29004，CHIR-99021，IWP2，维A酸（RA），VEGF165。

（二）实验操作流程

第一步：细胞制备

1. 在Essential 8培养基+0.5%青霉素/链霉素中培养hiPSCs，至汇合度~70–80%。
2. 每4天使用含5 mM EDTA的PBS（不含钙镁离子）给细胞传代。可选：接种细胞时加入2 µM Thiazovivin（ROCK抑制剂），以提高细胞消化解离后的存活率。
3. 第1天：在Essential 8培养基中加入2 µMThiazovivin，以每孔10000个hiPSCs的密度接种至超低吸附U型96孔板中。

第二步：中胚层的诱导

1. 准备含DMEM/F-12 + GlutaMAX、IMDM、脂质、转铁蛋白、BSA和α-硫代甘油的基础培养基。
2. 第0天：添加BMP4（10 ng/mL）、Activin A（50 ng/mL）、bFGF（30 ng/mL）、LY-29004（5 μM）、CHIR-99021（1.5 μM）。

第三步：分化为心脏中胚层

1. 第2天：使用添加胰岛素（10 µg/mL）、BMP4（10 ng/mL）、bFGF（8 ng/mL）、IWP2（5 µM）的基础培养基，视情况添加 5 μM RA。
2. 第6–7天：更换为含胰岛素、BMP4和bFGF的基础培养基，以促进心外膜分化与心肌成熟。
3. 第8天起：使用添加胰岛素（10 µg/mL）的维持培养基，视情况添加 VEGF（100 ng/ml）。

备注：BMP4与Activin A用于诱导中胚层及心脏祖细胞特化；bFGF用于促进祖细胞增殖；CHIR99021通过激活Wnt信号通路诱导早期中胚层形成；LY-29004用于抑制PI3K并精细调控分化信号。

第四步：培养维持与血管生成诱导（可选）

更换为心肌细胞维持培养基（CDM：BDM培养基+胰岛素），可选择性添加VEGF（100 ng/mL）以诱导血管形成。采用半量换液方式进行培养，并辅以低速轻柔摇床培养（40 rpm），以改善营养交换、促进类器官生长。

第五步：功能鉴定与应用

1. 可通过免疫荧光染色、qPCR或转录组测序等方法，对细胞分化效果进行检测与评估。
2. 该类器官模型可用于疾病建模、药物筛选及心脏发育机制研究等方向。

（三）培养技巧

1. 类器官形成监测、传代与扩增

• 包埋培养第3天起，每日在显微镜下观察类器官的结构形成与生长状态。
• 每2～3天更换新鲜维持培养基。
• 当类器官生长至适宜大小（50 μm～1000 μm，个体差异较大）时，将其切割为小组织块或采用机械法分离。
• 重新包埋于新鲜凝胶中，继续培养。

2. 生长因子

稳定提供心脏特异性信号是培养关键。高纯度重组蛋白（如HumanKine^® VEGF、FGF2、BMP4等）可有效促进心肌分化与血管模拟。

3. 细胞外基质（ECM）

使用Matrigel等基质胶或可调刚度的合成水凝胶等细胞外基质模拟物，可促进类器官的自组装及形成适宜的组织张力。

4. 质量控制检测

• 采用肉眼观察、显微视频分析或力学传感器等方式，对心肌收缩能力进行定性或定量评估。
• 用心肌特异性标志物（cTnT、ACTN2、NKX2-5）进行免疫荧光染色。
• 通过qPCR检测相关基因表达水平。
• 利用钙成像或多电极阵列进行心肌功能鉴定。

三、心脏类器官的应用

迄今为止，心脏类器官已被应用于多个研究领域，包括心脏发生发育机制模拟^[3]、遗传性与非遗传性心脏病模型构建^[4]、药物筛选与检测^[5]，以及再生医学相关研究^[6]。尤为重要的是，该模型可作为高度模拟的心脏病病理模型，用于心肌梗死、心肌纤维化、先天性心脏病及心律失常等疾病的研究^[7,8]。

四、总结

综上所述，生长因子通过调节心肌细胞与内皮细胞间的平衡，在心脏类器官构建中发挥重要作用。例如，在三维类器官体系中添加FGF与VEGF，可促进内皮细胞与心外膜细胞生成，但心肌细胞占比会低于二维单层培养体系^[4]。随着对更完善的心脏病造模系统的需求日益增长，精准调控各类细胞信号对稳定制备心脏类器官至关重要。

Proteintech可提供：

• HumanKine^®生长因子——用于类器官生成

• 高品质抗体——用于心脏类器官表征

参考文献：

1. Rowe, R.G. and G.Q. Daley. Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Genetics, 2019. 20(7): p. 377-388.
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