免疫沉淀试剂盒（HRP-抗兔 IgG 轻链）

使用方法

1. 细胞或组织裂解物的制备

 细胞

• 将离心机预冷至 4 °C。 

• 收集细胞前用血球计数板对细胞进行计数。 

• 4 °C、500 × g 离心 5 min，收集细胞。 

• 用冰上预冷的 1 × PBS 洗涤细胞三次，每 10⁶个 细胞加入 100 uL 预冷的 IP lysis buffer（现加Protease inhibitor至1 x）。若需获得高浓度蛋白裂解物，可以适量减少 IP lysis buffer 的使用。 

• 若靶蛋白为磷酸化蛋白质，则需额外加入适量磷酸酶蛋白抑制剂（货号：PR20015）。 

• 在 IP lysis buffer 中重悬细胞，冰上裂解 30 min，期间每 10 min 轻柔颠倒一次。 

• 后续步骤见裂解与保存。

组织

• 解剖目的组织，用预冷的 1 × PBS 洗涤组织，尽可能去除组织中存留的血液，在 冰上将目的组织剪成碎块。 

• 将组织碎块置于预冷的匀浆器中。 

• 以每毫克目的组织 10-20 uL IP lysis buffer 的量加入相应数量的 IP lysis buffer（现加Protease inhibitor至1 x）。 

• 对目的组织充分匀浆，冰上裂解 30 min，期间每 10 min 颠倒一次。 

• 后续步骤见裂解与保存。 

裂解与保存

• 超声波破碎细胞或组织裂解物，使得裂解更加充分，同时使 DNA 片段化。不同样品最适超声时间不同，在 180 W 功率下（超声2 s停2 s 的循环），一般细胞超声 1 min，组织超声 2-5 min，整个超声过程在冰上进行。 

• 裂解物冰上放置 20-30 min，期间每 10 min 颠倒一次。 

• 4 °C、10,000 × g 离心 10-15 min，将上清转入新的 EP 管中备用；弃沉淀或 储存用于后续问题分析。 

• 通过 BCA 法测定裂解物的总蛋白浓度。 

• 裂解物用于 IP 或 Western blotting 实验，也可以分装于-80 °C 保存。 

• 若用于 Western blotting 实验，SDS-PAGE 检测前，需向裂解物中加入 25% 样品体积的 5 × Sample buffer，并沸水浴加热 5 min。 

2. rProtein A/G beads 的准备 

• 上下颠倒混匀储存 rProtein A/G beads slurry 的管子，取出所需数量的 rProtein A/G beads slurry，用 1 x PBS 低速离心洗涤 beads 三次（每次可1 mL PBS，500 g 离心30 s），最后用 PBS 将 beads 重悬至原体积。

3. 裂解物预处理（可选） 

• 以 45°角剪掉已灭菌枪头的末端，快速吸取重悬的 rProtein A/G beads slurry，加入含有裂解物的 EP 管中。通常 1-3 mg 总蛋白裂解物需加入 30 uL 重悬的 rProtein A/G beads slurry。 

• 4 °C 旋转孵育 30-60 min（推荐用垂直旋转混合仪，低速旋转）。 

• 4 °C、500 g 离心 1 min，将上清转入新的 EP 管中。 

4. 免疫沉淀 

• 吸取含有 1-3 mg 总蛋白的裂解物(或预处理）200-350 uL，加入下端带有 End caps 的 Spin columns 中，同时加 入 1-4 ug 特异性抗体以及 150-300 uL Incubation buffer，最佳抗体数量应由抗体效价决定。 

• 向相同数量的裂解物与 Incubation buffer 中加入同种属相同数量的 Control IgG 作为阴性对照（阴性对照管的 后续操作与目的样本管完全一样）。 

• 4 °C 下，旋转孵育过夜或 2-4 h。 

• 向 Spin columns 中加入 50 uL 重悬的 rProtein A/G beads slurry 以沉淀免疫复合物，4 °C 旋转孵育 1-4 h。 

• 取下 End caps，将上清自然流出弃除，必要时，可以通过重悬 rProtein A/G beads 以提高上清的 流速。 

• 每次用 800 uL 1 × Washing buffer（取适量 20 x Washing buffer、用纯水稀释至1 x ，并现加 Protease inhibitor 至1 x）洗涤沉淀复合物，洗涤液自然流出弃除；重复洗涤 4-5 次。洗涤结束后，在 4 °C，500 g 下将 Spin columns 置入 Collection tubes 中离心 30 s，弃 Collection tubes 以及离心产物。 

5. 洗脱 

• 将 Spin columns 置入新的 1.5 mL EP 管中以收集洗脱产物，用 40 uL Elution buffer 洗脱沉淀复合物，室温静置 5-10 min，然后 4 ℃ 10000 g 下离心 1 min 收集产物，取新的 40 uL Elution buffer 重复洗脱一次（2 次洗脱合并收集）。 

• 向全部洗脱产物中加入 10 uL Alkali neutralization buffer 以及 23 uL 5 × Sample Buffer ，沸水浴加热 5 min。

6. Western blotting 分析 

• 取 20-40 uL IP 样品加入 SDS-PAGE 对应泳道， 同样可以将剩余 IP 样品置 于-80 °C 保存备用。 

• 通过 SDS-PAGE 分离 IP 样品，并将蛋白质向 PVDF 膜转移。使用检测抗体杂交以及 1:1000-1:2000 稀释度的 HRP-conjugated Mouse Anti-Rabbit IgG Light Chain Specific 二抗进行 Western blotting 分析。 

补充信息 

• 如果需要缩短 IP 实验操作时间，也可以将靶蛋白对应的特异性抗体以及 rProtein A/G beads slurry 同时加 入细胞或组织裂解物中进行一步孵育。 

• 必要时，该试剂盒可以按比例扩大使用