线粒体分离及蛋白提取试剂盒

使用方法

1、提取前准备：将试剂盒中溶液室温解冻，解冻后放置于冰上。提前4℃预冷离心机。如果用于制备线粒体蛋白样品，线粒体分离液A、线粒体分离液B、线粒体分离液C、线粒体洗涤液、线粒体裂解液根据提取的样本量分别取出对应体积的试剂，在使用前按100:1添加蛋白酶抑制剂混合液（100×）备用。

2、样品预处理

a、对于细胞：收集细胞4℃，500 g离心5 min，用预冷的PBS洗涤两遍。然后在冰上，按每2000万细胞直接加入1 ml预冷的线粒体分离试剂A。

b、对于组织：现取新鲜的动物组织，用冰的PBS洗净组织块上附着的脂肪和血液等杂质，用滤纸吸干水分后称重，在离心管中将组织块剪碎，然后在冰上，按每100 mg组织加1 ml预冷的线粒体分离试剂A。

3、样品匀浆：将样品悬液转移到合适大小的预冷玻璃匀浆器中，在冰浴条件下对样品匀浆。

注：不同的样品所需匀浆次数不同，培养细胞建议匀浆3-5次，组织样本建议5-10次。鉴定方法：取20 ul匀浆3次后的细胞样品或匀浆5次后的组织样品，加入等体积的0.4%台盼蓝溶液，混匀，在显微镜下观察台盼蓝溶液染色阳性（蓝色）细胞数目的比例，当阳性（蓝色）细胞破碎达到60%即可停止匀浆，请勿过度匀浆。若阳性（蓝色）细胞比例未达到60%，适当增加1-2次匀浆，随后按照同样的方法使用台盼蓝溶液进行鉴定。

4、线粒体粗分离：根据步骤3中样品匀浆液的体积，取等体积的线粒体分离试剂B加至离心管底部，然后沿管壁缓慢地加样品匀浆液使其覆盖于上层。对于培养的细胞样品使用4℃，600 g离心10 min，收集最上层分离层。对于组织样品使用4℃，700 g离心10 min，收集最上层分离层。

注：（1）匀浆液置于线粒体分离试剂B上层时要沿管壁小心加入，同时及时离心，以防匀浆液中的颗粒自然下沉，影响后面的离心分层效果。

（2）离心后上清会分成2层，收集最上层分离层。如果分层不明显则将所有上清收集。

5、将收集的上清转移至新的1.5 ml EP管中，每管1 ml。4℃，10000 g离心10 min，收集沉淀。收集得到的沉淀即为粗线粒体。

6、高纯度线粒体分离

a、高纯度线粒体分离液准备：按照线粒体分离液C：线粒体分离液D=17:3的比例配制，现用现配。按照每管（1.5 ml EP）0.5 ml提前加入新的EP管中。

b、将步骤5中的粗线粒体沉淀按每管（1.5 ml EP）加入0.5 ml的线粒体洗涤液重悬。

c、将重悬的粗线粒体缓慢的加入到高纯度线粒体分离液的上层。4℃，22000 g离心10 min，收集沉淀。

d、每管沉淀加入1 ml的线粒体洗涤液重悬沉淀，4℃，16000 g离心5 min，收集沉淀。收集到的沉淀为高纯度的线粒体。

7、线粒体染色鉴定：取适量沉淀涂片，滴加Janus Green B染液染20 min，盖上盖玻片，在显微镜下镜检。在显微镜下线粒体呈现出蓝绿色小棒状或哑铃状。

8、线粒体的使用

a、用于完整线粒体的功能或酶活性研究：初始2000万个细胞或100 mg组织可以加入200 uL线粒体保存液，重悬线粒体，并及时使用。如果不能及时使用，建议-80℃保存。冻存后的线粒体样品不推荐用于完整线粒体的功能的研究，但可以用于线粒体蛋白分析、免疫印迹、免疫沉淀等实验。

b、用于线粒体蛋白分析：初始2000万个细胞或100 mg组织可以加入100 uL线粒体裂解液（线粒体裂解液在使用前按每100:1添加普通型蛋白酶抑制剂混合液），裂解后的线粒体样品可以用于PAGE、免疫印迹、免疫沉淀等后续实验。

c、用于免疫印迹：裂解后的线粒体样品按照3:1比例，混合线粒体的蛋白样品和SDS-PAGE上样缓冲液。100℃沸水浴加热5 min，以充分变性蛋白。冷却至室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。