终于来了！你们催了800遍的小分子蛋白质与多肽Western Blot超详细教程！

在生命科学实验室里，流传着这样一句话：“跑大蛋白靠运气，跑小蛋白靠神力”。

分离10kDa以下的低分子量蛋白和多肽，是业内公认的“老大难”问题。相信每一位做过小分子WB的科研人都经历过这样的至暗时刻：

▶ 好不容易提的样品，跑胶时直接“溜”出凝胶底端

▶ 转膜一夜醒来，膜上干干净净，蛋白早已“穿越”到滤纸里

▶ 明明目的条带在5kDa，结果 marker 都跑散了，目标在哪全靠猜

是的，我们都知道Tricine胶体系是解决小分子分离的“金标准”。市面上关于Tricine-SDS-PAGE的文献也确实不少，但真正实操过的同学都懂——从“知道”到“跑出来”，中间隔着整个实验体系的推倒重来！

传统的Tris-Glycine体系我们早已驾轻就熟，但切换到Tricine体系，意味着：

▶ 蛋白样品要重制

▶ 凝胶配方要重学

▶ 电泳液、转膜液全部换新

▶ 连电泳程序都要从头摸索

实在是太繁琐了！

有没有一种方法，能在我们熟悉的Tris-Glycine体系下，运行出Tricine胶的效果？

今天，我们就来给大家送上一份真正能打印出来照着做的小分子WB实操说明书，帮你打通小蛋白分离的“任督二脉”！

一. 样品制备：小分子WB的“第一颗扣子”

小分子蛋白样品制备与常规WB有着显著区别，核心痛点在于：小蛋白极易丢失、极易降解、极易被拉宽弥散。制备时应避免使用过于剧烈的离子去垢剂，SDS浓度建议控制在≤1%，同时加入新鲜配制的蛋白酶抑制剂混合物也必不可少。样品的裂解操作按照常规Tris-Glycine体系的要求进行即可，但真正的核心差异在于上样缓冲液——话不多说，先上配方（见下表）。

该缓冲液专为优化小分子量蛋白质和多肽的电泳分离而配制，与传统Tris-Glycine体系的上样缓冲液相比，能让小分子量蛋白质条带更平整、分辨率更高。那么问题来了：用Tris-Glycine体系制备的蛋白样品，能否直接在Tricine体系下使用？当然可以，但条带可能会出现不平整、宽大、不完整等情况（见下图1、2的第一泳道，图3第1、3泳道）。从精益求精的角度来看，Tricine SDS样品缓冲液制备的蛋白样品，条带表现确实更胜一筹。

此外，还有一个极易被忽视的细节：在Tricine电泳体系下，溴酚蓝的电泳速度比部分多肽（尤其是5 kDa以下）更慢。为确保指示准确，建议在样品中加入0.005%酚红，或点一孔空白的Tricine SDS样品缓冲液作为指示，当酚红跑到凝胶底部时即可结束电泳（见下图），避免目的条带跑出凝胶。 

二. 制胶：三层胶并非唯一答案，选对配方才是关键

提起Tricine胶，大家的第一反应往往是那“积层胶—间隔胶—分离胶”的三层结构，光是听着就觉得做胶太麻烦。那么，小分子WB真的非做三层胶不可吗？其实不然——对于5 kDa以上的蛋白质分离，通过10-20%的梯度胶就能满足绝大多数需求；如果实验室没有配制梯度胶的设备，10%的均一胶同样可行。

如上图所示，我们用10%均一胶跑组蛋白，条带压得依然平整，且这种胶在实验室里完全可以自己动手配制（配方见下表）。

当然，如果要分离5 kDa以下的蛋白质和多肽，三层胶就很有必要了：此时需将胶的C值（交联度）从3%提升至6%，并在中间添加约1 cm的间隔胶，这能让1-5 kDa的条带变得更加清晰（三层胶配方见下表）。

相信也会有好奇宝宝纠结：C值从3%升到6%，条带到底会发生什么变化？我们直接上结果图（见下图）——可以看到，C值变大后胶体变得“更浓”，孔径更小，更适合小分子分离，条带也会压得更加平整。感兴趣的宝宝不妨自己动手试试，感受一下配方微调带来的显著差异。

三. 电泳：两种电泳液是标配，电泳时间可以“偷个懒”

Tricine体系需要两种不同的电泳液（阳极液和阴极液），这一点与常规Tris-Glycine体系完全不同。阳极缓冲液（正极槽/外槽）提供稳定的离子环境，维持pH；阴极缓冲液（负极槽/内槽）中的Tricine则作为尾随离子，负责分离小肽，在整个体系中起到决定性作用。好在这两种电泳液的配方都相对简单，配制起来非常方便（配方见下表）。

说到电泳这一步，最让人糟心的莫过于速度太慢——先30V再转150V，冰浴电泳动不动就要2.5小时以上，实在太折磨人。那么，有没有更快的条件呢？通过小编亲测，对于5 kDa以上的蛋白质分离，直接使用125V冰浴从头跑到尾，10-20%梯度胶基本可以在60分钟左右结束战斗。当然，如果是5 kDa以下的蛋白质或多肽，还是乖乖推荐30V转150V的慢速电泳模式，毕竟小肽分离，稳比快更重要。

四. 转膜：小分子WB的“生死关”，选对方式才能“拦住”小肽

转膜是小分子WB成功与否的决定性一步。在常规转膜液中，小肽极易直接穿膜而过，我们必须想方设法“拦住”它们。孔径0.2 μm的PVDF膜是我们的首选（切记不能用0.45 μm，否则小肽会直接漏过）。至于半干转和湿转哪个更好，这一直是实验室争论的焦点。今天小编直接提供两种转移方式及优化条件，均经过Proteintech大量靶点的实战考验，效果都很能打，大家可以根据自己的设备情况自行选择（具体参数见下表）。需要提醒的是，如果是5 kDa以下的蛋白质或多肽，可以通过适当缩短转移时间来进一步优化，避免目的条带直接“转穿”。

（看到湿法转移液的配方，是不是有种“老熟人”的感觉？没错，它其实就是我们常规Tris-Glycine体系的转膜液，我们只是巧妙地通过调整转移条件，就达到了小分子WB所需的理想效果——是不是特别机智？）

五. 免疫印迹：跨过转膜这道坎，后面就是“常规操作”

转移完成后，将膜取出，使用封闭液在37℃水平恒温摇床中封闭1小时，即可进入后续的免疫印迹实验。这里可以松一口气：从一抗孵育开始，后续的所有步骤与常规Tris-Glycine体系完全一致，无需再做任何特殊调整。如果你已经熟练掌握了常规WB的抗体孵育、洗膜和曝光流程，那么恭喜你，小分子WB最难的部分已经攻克，剩下的就是“复制粘贴”你的熟练操作。