易降解蛋白提取试剂盒

Cat No : PK10024

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产品介绍

消化系统(胃肠道等)、生殖系统(睾丸、卵巢等)、腺状体(胰腺、胸腺等)、肺、肝脏、斑马鱼及一些易降解的细胞(如:巨噬细胞类RAW 264.7、淋巴细胞类U-937、单核细胞类THP-1)等样品,含有丰富的蛋白酶,在制样过程中会被释放到裂解液中,将靶标蛋白内源性剪切而碎片化,形成片段更小的杂带,从而增加了我们蛋白提取的难度。Proteintech研发的这款易降解蛋白提取试剂盒通过改进裂解液组分,能够有效的防止样品在制备过程中的降解,同时此款试剂盒提供了非变性和变性两款裂解液,客户可根据下游检测选择合适的裂解液。得到的蛋白样品可用于蛋白免疫印迹、免疫沉淀、ELISA等蛋白分析实验。

关于试剂盒

●本试剂盒提供了两款裂解Buffer,易降解蛋白裂解BufferA是一款变性裂解Buffer,提取的样品仅推荐使用SDS-PAGE,免疫印迹等实验,而裂解BufferB是一款基于非变性去垢剂来制备与多数下游检测兼容的裂解物,包括蛋白免疫印迹、免疫沉淀、ELISA检测,蛋白质分析等。

●用于SDS-PAGE,免疫印迹等变性蛋白的研究,推荐使用易降解蛋白裂解BufferA,其具有更强的裂解能力,能有效阻止蛋白酶对蛋白的降解,保护目标蛋白完整性。

●易降解蛋白裂解BufferA在低温下会析出,可使用30℃水浴复溶。

●易降解蛋白裂解BufferA和B在使用前加倍添加新鲜的蛋白酶抑制剂混合物(即1 mL加入20-30 uL),用于磷酸化样本的制备推荐使用专用的磷酸化蛋白提取试剂盒(货号:PK10023)。

●此试剂盒适用于消化系统(胃肠道等)、生殖系统(睾丸、卵巢等)、腺状体(胰腺、胸腺等)、肺、肝脏、斑马鱼及一些易降解的细胞(如:巨噬细胞类RAW 264.7、淋巴细胞类U-937、单核细胞类THP-1等)等样品。

●样品制备完成后及时使用或分装保存在-80℃。

●如果每个样品的数量为1000万个细胞或100 mg组织,本试剂盒可以处理30个样品。

●试剂盒各组分需在室温完全解冻后再使用,试剂盒过期后建议不要使用。


组分规格保存条件
易降解蛋白裂解BufferA30 mL-20℃保存一年
易降解蛋白裂解BufferB5 mL-20℃保存一年

SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(4X)

10 mL-20℃保存一年
增强型蛋白酶抑制剂混合物(100X)0.5 mL-20℃保存一年

0.4%台盼蓝溶液

1 mL-20℃保存一年


保存条件

-20℃保存,一年有效。一个月内使用可4℃保存。


使用方法

1. 易降解类细胞(如:巨噬细胞类RAW 264.7、淋巴细胞类U-937、单核细胞类THP-1等):使用离心法收集细胞

1.1 使用细胞刮收集细胞悬液(连同培养基一起收集),4℃,500 g离心5 min,收集沉淀,沉淀用预冷的PBS(使用前添加新鲜的蛋白酶抑制剂混合物)洗涤两遍,收集细胞沉淀,尽可能吸取残留的PBS。

1.2 按每1000万细胞加入1 mL易降解蛋白裂解BufferA或B(蛋白裂解Buffer在使用前添加新鲜的蛋白酶抑制剂混合物)。

注意:

(1)加入易降解蛋白裂解BufferA后,样品粘度会很高,无需在冰水放置30 min,可以直接冰浴进行超声破碎。

(2)使用易降解蛋白裂解BufferA的操作,温度过低会析出,推荐在4℃冰箱或加冰块的泡沫箱中操作即可。如果出现温度过低样品析出的情况,可将样品放在室温直至重新复溶。

(3)用于IP、CO-IP、ELISA检测等实验选用易降解蛋白裂解BufferB制备样品,不要选用易降解蛋白裂解BufferA制备。

2. 易降解组织样本:消化系统(胃肠道等)、生殖系统(睾丸、卵巢等)、腺状体(胰腺、胸腺等)、肺、肝脏等。

2.1 组织的采集与保存

(1)采集组织样本前先对动物去除血液(血液去除越干净越好),接着迅速解剖,采集所需要的组织样本,浸泡在添加了增强型蛋白酶抑制剂混合物冰的PBS中。

(2)消化系统(胃肠道等)、生殖系统(睾丸、卵巢等)、腺状体(胰腺、胸腺等)、肺、肝脏、斑马鱼及一些易降解的细胞(巨噬细胞和淋巴细胞类)等样品现取现制备,不推荐冻存。 

2.2 组织样清洗

(1)对于血液含量丰富的易降解组织样本如:肝脏、肺等组织,剪碎使用添加了增强型抑制剂混合物冰的PBS洗涤液清洗2-3遍(可以适当按压排出血液),直至样本血红色变浅,滤纸吸干水分称重。

(2)对于脂肪含量丰富的易降解组织样本,预先把样本放在几层纸巾上按压,去除部分脂类,然后再使用添加了增强型抑制剂混合物冰的PBS清洗1-2遍,滤纸吸干水分称重.

(3)对于胃肠道等易降解组织样本:剥离干净胃肠道表面的脂肪,然后使用注射器吸取含有增强型抑制剂混合物的PBS对胃肠道里面进行冲洗数次(请勿直接剪开刮洗,容易丢失胃肠道表面肠黏膜等相关蛋白),直至流出的PBS干净无异物,滤纸吸干水分称重。

2.3 组织样破碎及裂解

a. 液氮研磨法:将剪碎的组织块在研钵中加入液氮,快速研磨至细粉状,转移至EP管中,按每100 mg组织加1 mL预冷的易降解蛋白裂解BufferA或B(蛋白裂解Buffer在使用前添加新鲜的蛋白酶抑制剂混合物),使用移液器上下吹打混匀,直至完全溶解。

 b. 冷冻研磨机法:提前开启冷冻研磨机预冷,将吸干水分的组织样本剪成1-2 mm左右的小块,按照每管100 mg分装到2 mL离心管,同时每管加入1粒5 mm的研磨珠。将离心管和适配器放入液氮里浸泡速冻。将离心管和适配器转移到冷冻研磨机,使用65HZ研磨45 s,如果研磨效果不理想可中断15 s后重复研磨一次。每管加1 mL预冷的组织样品裂解BufferA或B(蛋白裂解Buffer在使用前添加新鲜的蛋白酶抑制剂混合物),使用移液器上下吹打混匀,直至完全溶解。

注意:

(1)优先推荐选用液氮研磨法和冷冻研磨机法,其破碎效果最佳;不推荐使用匀浆法,匀浆法易产生热量,加快降解。

(2)使用冷冻研磨机法对液氮速冻过的样本进行破碎,对离心管的材质要求比较高,需选用专用的离心管。

(3)用于SDS-PAGE,免疫印迹等变性蛋白的研究,推荐使用易降解蛋白裂解BufferA,其具有更强的裂解能力和阻止蛋白酶对蛋白的降解,能有效的保护目标蛋白完整性。

(4)加入易降解蛋白裂解BufferA后,样品粘度会很高,无需在冰水放置30 min,可以直接冰浴进行超声破碎。

(5)使用易降解蛋白裂解BufferA的操作,温度过低会析出,推荐在4℃冰箱或加冰块的泡沫箱中操作即可。如果出现温度过低样品析出的情况,可将样品放在室温直至重新复容。

(6)用于IP、CO-IP、ELISA检测等实验选用易降解蛋白裂解BufferB制备样品,不要选用易降解蛋白裂解BufferA制备。

3. 斑马鱼等冷血动物类:推荐匀浆法

(1)取适量易降解蛋白裂解BufferA或B(蛋白裂解Buffer在使用前添加新鲜的蛋白酶抑制剂混合物),在70℃水浴锅中预热。

(2)将清洗干净的斑马鱼吸干水分,按每100 mg组织加1 mL预热的组织样品裂解BufferA或B,在70℃水浴锅中匀浆30-50次。期间可取适量样品使用台盼蓝染色鉴定破碎程度,直至完全破碎。

鉴定方法:取20 uL匀浆30次后的样品,加入等体积的0.4%台盼蓝溶液,混匀,在显微镜下观察台盼蓝溶液染色阳性(蓝色)细胞数目的比例,当阳性(蓝色)细胞完全破碎,即可停止匀浆。若阳性(蓝色)细胞破碎不完全,则可适当增加5-10次匀浆,随后按照同样的方法使用台盼蓝溶液进行鉴定。 

4. 超声处理:将裂解的蛋白样品放在冰上超声破碎,200 W,2 min(开2 s,关2 s),冰上放置2 min后再重复200 W超声2 min一次,充分打断核酸序列。 

5. 样品的使用与保存

5.1  用于免疫沉淀、ELISA等非变性蛋白分析实验,4℃,10000 g离心5 min分离上清,取部分样品用来测浓度,剩下的蛋白样品可直接分成数管保存在-20℃或-80℃。

5.2  用于免疫印迹的变性蛋白分析实验,取部分样品用来测浓度,剩下的蛋白样品按照3:1比例,混合蛋白样品和SDS-PAGE上样缓冲液。100℃沸水浴加热5 min,以充分变性蛋白。冷却至室温后,4℃,10000 g离心5 min分离上清,可直接上样到SDS-PAGE胶加样孔或分成数管保存在-20℃或-80℃。

注意:

    用于免疫印迹的变性蛋白分析,在加入SDS-PAGE上样缓冲液煮样后再离心,可提高总蛋白的得率。


注意

1. 提取的易降解蛋白样品的所有步骤都需在低温下进行。

2. SDS-PAGE蛋白上样缓冲液中含少量DTT,有轻微刺激性气味,但不含剧毒的巯基乙醇。为取得最佳的使用效果,尽量避免过多的反复冻融,可以适当分装使用。

3. 提取得到的总蛋白可以使用Proteintech的BCA蛋白浓度检测试剂盒(货号:PK10026)测定蛋白浓度,不适用Bradford法测蛋白浓度。

4. 本试剂盒中试剂都应在室温下溶解,请勿加热。

5. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴好一次性手套操作。


问题解答

问题可能原因解决方案
裂解不充分裂解液加入量过少加充足的裂解液
样品浓度低裂解液加入量过多

减少加入的裂解液

样品粘度大核酸未被打断成小片段对样品进行超声波处理
离心后沉淀多裂解不充分

加大裂解液的使用量