解析beta-Actin多带之谜

2017年6月

2017年6月

从上个世纪70年代起,就有科学家陆续发现,有很多酶都可以降解actin(由于不同actin亚型序列差别不大,所以下面统称actin), 包括我们熟知的凝血酶Thrombin(PMID 4210209)、组织蛋白酶B Cathepsin B(PMID 7298595)等等,甚至还有文章报道一些细菌的蛋白酶(PMID 16128395)也可以降解actin。

此外,actin还可以经泛素-蛋白酶体系统降解(PMID 16738015),在细胞凋亡时actin也会降解(PMID 14702115),对于有些物种在特殊的刺激下也会降解(PMID 19796626)。

从上面提到的这些文章来看,42 kDa的actin,发生降解后会产生37 kDa(或35-38 kDa)、~30 kDa, 15 kDa等典型片段来,而且37 kDa(或35-38 kDa)的片段最为常见,这是因为不少酶都会在Val43和Met44这两个氨基酸中间切开它。

因此,如果WB采用的抗体识别的位点是前43aa,那么就检测不到降解出来的大片段,而小片段一般会跑出胶去,这样看起来就会只有一条带。

综上所述,如果actin出现多条带,建议从以下几个方面考虑解决:

1. 像上面提及的凝血酶、组织蛋白酶等在各组织里和细胞里的分布比较广泛,在裂解过程中它们极有可能是降解actin的主要因素,因此需要设法抑制蛋白酶活性,比如引入蛋白酶抑制剂、避开蛋白酶最适活性温度等;

2. 对于贴壁细胞,在传代过程中使用的胰酶也是一个潜在威胁,在传代的时候需要控制好消化时间,防止消化过度,尤其是在最后一次传代时,细胞密度尽量传低,以充份稀释残留的胰酶,同时提高未被降解的细胞的比例;

3. 保持细胞处于良好的状态,防止发生凋亡。对于研究凋亡的童鞋来说,可以考虑用其它内参;

4. 细胞被微生物污染、防止裂解产物被微生物污染,提蛋白的全部器皿尽可能干净无微生物污染。

尽管上面列了不少注意事项,但是对于有些富含大量蛋白酶的组织(如消化系统组织)和细胞(如U-937, Raw264.7等细胞),依然有较大可能出现actin被降解的可能,此时我们推荐货号66009-1-Ig的β-actin 单抗。

样本:

Raw264.7, RIPA裂解, 20ug/lane

一抗 (β-actin antibody ):

左边 (货号:60008-1-Ig), 1:80000

右边 (货号:66009-1-Ig) , 1:100000

曝光时间: 2min  

Proteintech的60008-1-Ig可以识别出一条降解片段来,但是66009-1-Ig只能测出全长来,原因就是因为这个抗体识别的位点位于前43aa内。

另外需要注意的是,N端的序列在物种间的保守程度不如C端,所以Proteintech 60008-1-Ig actin单抗可以识别更广泛的物种,最低可以识别酵母actin, 而66009-1-Ig只能识别线虫或更高等的动物。此外,60008-1-Ig亚型为IgM,所以不适合做IP实验

样本:HEK-293,  RIPA裂解, 20ug/lane

一抗:60008-1-Ig

1:1W, 2W, 4W, 8W, 16W

曝光时间:1min

样本:HEK-293,  RIPA裂解, 20ug/lane

一抗:66009-1-Ig

1:1W, 2W, 4W, 8W, 16W, 32W, 64W  

 曝光时间:1min

这两个actin单抗产品的对比如下:

货号 亚型 应用 反应种属 对降解片段的识别
66009-1-Ig

IgG2b

ELISA, FC, IF, IHC, IP, WB

线虫及更高等

极少

60008-1-Ig

IgM

ELISA, FC, IF, IHC, WB

酵母及更高等

可识别35-38kD的降解带

所以,当实在无法解决β-actin出现降解条带但又对WB图片要求较高的,如果确认目的蛋白不受降解影响或影响极小的,可以考虑采用Proteintech 66009-1-Ig来解决。


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Posted:
5 July, 2017

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